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Biotecnologia
Biotecnologia
Biotecnologia
Engenharia Genética ou Tecnologia do DNA recombinante ou biotecnologia
É um conjunto de técnicas de laboratório que permite alterar o DNA, eliminando ou acrescentando pedaços e, portanto, modificando as informações genéticas nele contidas. As principais ferramentas
utilizadas na engenharia genética são:
- Ferramentas da biologia Molecular.
a) Enzimas polimerases – Taq polimerase
A Taq DNA polimerase, também denominada Taq polimerase ou apenas Taq é uma DNA polimerase
termoestável, utilizada na amplificação de fragmentos de DNA através da técnica de PCR. O seu nome é
devido a ter sido identificada pela primeira vez na bactéria Thermus aquaticus, uma extremófila encontrada em
fontes hidrotermais.A Taq polimerase suporta as elevadas temperaturas usadas em PCR, tendo uma semi-vida
enzimática de 40 minutos (a 94°C). Está enzima é utilizada na técnica de PCR, que tem como objetivo aumentar o numero de cópias do DNA para que este possa ser utilizado em diversas técnicas de biotecnologia.
b) Enzimas de restrição
As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição como também são conhecidas, são enzimas que cortam a molécula de DNA através do reconhecimento de sequências nucleotídicas específicas. São substâncias fabricadas naturalmente por bactérias para destruir o DNA de vírus invasores, elas cortam os ácidos nucléicos em locais específicos. Atualmente conhecemos mais de 200 enzimas de restrição. As enzimas de restrição reconhecem pontos específicos (sítios de restrição) no DNA duplo, local em que cortam as seqüências de nucleotídeos, originando os fragmentos conhecidos como extremidades coesivas. Cada extremidade pode se unir a outra, desde que seja um palíndromo, isto é, uma região de DNA com repetições invertidas. Geralmente reconhece sequencias
palindromicas.
↓
5'-GAATTC-3'
3'-CTTAAG-5' as setas indicam o lugar de corte
↑
c) Plasmídeos
Os plasmídeos ou plasmídios são moléculas circulares duplas de DNA capazes de se reproduzir independentemente do DNA cromossómico. O seu tamanho varia entre poucos milhares a mais de
cem mil pares de bases.
d) DNA ligase
DNA ligase é a enzima que une os fragmentos de Okazaki, após a retirada dos iniciadores (ou primers) pela enzima primase. Também é utilizada como ferramenta em técnicas de Biologia Molecular para “colar” fragmentos de DNA de interesse.
USOS POTENCIAIS DA ENGENHARIA GENÉTICA
- Identificação e função de genes em animais e vegetais.
- Desenvolvimento de doenças humanas em animais, facilitando o seu estudo e a busca de novas terapias.
- Produção de proteínas de interesse médico por meio dos animais transgênicos.
- Desenvolvimento de animais transgênicos para doação de tecidos ou órgãos para o transplante em humanos. Desenvolvimento de vegetais mais resistentes a pragas e de melhor qualidade.
- Desenvolvimento de raças de animais transgênicos de crescimento mais rápido e de melhor qualidade para o consumo.
Tecnicas utilizadas em Engenharia genética
1- Reacção em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou
leveduras.
Inventada em 1983 por Kary Mullis, a PCR é uma das técnicas mais comuns utilizadas em laboratórios de pesquisas médicas e biológicas para diversas tarefas, como o sequenciamento de genes e diagnóstico de doenças hereditárias, identificação de fingerprint genético (usado em testes de paterninade e na medicina forense), detecção de diagnóstico de doenças infecciosas e criação de organismos transgênicos.
A PCR encontra sua principal aplicação em situações onde a quantidade de DNA disponível é reduzida. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações da PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo que contenham
bulbo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting.
O PCR também é rotineiramente utilizado em procedimentos científicos de Biologia Molecular como amplificação para gerar mutagênese, detecção de mutações ou preparação de fragmentos de DNA para clonagem (inserção em plasmídeo, por exemplo) como também pode ser utilizado para identificação de patógenos que estão presentes em amostras como por a exemplo identificação de agentes como Cândida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vírus do papiloma humano e seus genótipos, HIV Vírus da Hepatite B. etc A PCR também é utilizada na paleontologia para o sequenciamento gênico de animais pré-históricos. Também é muito utilizada na identificação de microrganismos, tendo em vista que apenas 1% dos microrganismos são cultivaveis e podendo ser isolados.
A PCR é o primeiro passo para o posterior sequenciamento. Após obter as sequencias geradas pelos equipamentos pode-se consultar bases de dados na internet para tentar localizar suas possiveis origens, sendo bactérias, archeas ou etc.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de análise e por isso é realizado com muito cuidado para evitar contaminações que possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. O processo consiste basicamente em utilizar os mecanismos da replicação in vitro. Os cientistas então simplificaram ao máximo o processo de polimerização das moléculas. A maquinaria para separar as fitas sense e anti-sense são muito complexas na célula, no lugar utiliza-se a mudança de temperatura. Os ciclos são pensados para disponibilizar o sitio alvo para a ligação dos primers, funcionamento da polimerase e iniciou de um novo ciclo. Em primeiro lugar, deve-se extrair o material genético da célula ou outro material a ser estudado (exemplo: vestígios de crimes) sem danificá-lo. Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA (ARN) em uma RT-PCR que é umdesdobramento da PCR onde o DNA é sintetizado a partir do RNA, utilizando uma enzima chama transciptase reserva.
Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com um três fosfato, os primers (também chamados de oligonucleotídeos ou iniciadores) e a enzima DNA polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador, o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos para cada reação (fragmento a ser amplificado).
DESNATURAÇÂO
Essa etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96 °C por pouco tempo para que haja a
separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação, quebra das pontes de hidrogênio).
ANELAMENTO
Na segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60 °C dependendo da quantidade de citosina(C) e guanina (G) encontrada no primer, para que os primers se anelem (emparelham) com a fita molde de DNA (anelamento).
EXTENSÃO
Na última etapa do ciclo a temperatura é elevada a 72 °C para que a enzima possa funcionar sintetizando a nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é exponencial
O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida e depois é
interpretado com a ajuda de um profissional competente. Geralmente um padrão de peso molecular é adicionado em uma das fileiras do gel, assim poderá se avaliar o tamanho do fragmento amplificado.